RZS jest przewlekłą chorobą zapalną stawów, charakteryzującą się głównie nadżerkowym zapaleniem błony maziowej, ale również wykazuje ona cechy uogólnionego stanu zapalnego. Ten z kolei odgrywa kluczową rolę w patomechanizmie rozwoju miażdżycy. W badaniach populacyjnych wykazano, że RZS związane jest ze zwiększonym ryzykiem przedwczesnego rozwoju miażdżycy, a choroby układu sercowo-naczyniowego są wiodącą przyczyną zgonów w tej populacji chorych. Z kolei kluczowa cytokina w patomechanizmie RZS, czyli TNF, sprzyja aktywacji komórek śródbłonka oraz syntezie cząsteczek adhezyjnych odpowiedzialnych za gromadzenie się w ścianie tętnicy leukocytów, w tym makrofagów piankowatych. Co ważne, udowodniono także, że leki biologiczne, w tym inhibitory TNF, przyczyniają się do poprawy funkcji śródbłonka oraz do zmniejszenia ryzyka sercowo-naczyniowego u chorych, u których obserwuje się kliniczną odpowiedź na stosowane leczenie. Celem poniższego badania była ocena wpływu certolizumabu pegol na funkcje komórek śródbłonka w modelu in vitro w kontekście aterogenezy.

W eksperymencie wykorzystano hodowlę ludzkich komórek śródbłonka, pochodzących z aorty (HAoECs). Komórki inkubowano tylko w pożywce jako grupę kontrolną lub w pożywce z TNF w stężeniu 10 µg/ml lub w pożywce z TNF (10 ng/ml) oraz certolizumabem pegol (5 µg/ml). W celu oceny zmian w profilu ekspresji genów oraz w wewnątrzkomórkowej lokalizacji białek wykorzystano szereg technik biologii molekularnej, jak analiza mikromacierzy, izolacja RNA, RT-qPCR, immunofluorescencja, Western blotting czy też cytometria przepływowa.

W przeprowadzonych eksperymentach wykazano, że inkubacja komórek HAoECs z TNF związana była z istotnym wpływem na ogólną zmianę ekspresji genów, podczas gdy komórki inkubowane z TNF w połączeniu z certolizumabem cechowały się profilem ekspresji genów porównywalnym z grupą kontrolną. W przypadku 211 genów stwierdzono, że ich wielkość stopnia ekspresji uległa co najmniej 2-krotnej zmianie. Szczególnie obserwowano to w wypadku genów dla cząsteczek adhezyjnych. I tak na przykład stopień ekspresji genu dla selektyny E, VCAM-1 oraz ICAM-1 uległ zwiększeniu, odpowiednio, 21,6-, 17,8- oraz 8,8-krotnie. Co ważne, inkubowanie komórek zarówno z TNF, jak i certolizumabem pegol wiązało się z zahamowaniem zwiększenia stopnia ekspresji wspomnianych genów.

W innym eksperymencie z 24-godzinną inkubacją komórek z TNF wykazano, że po 1h stopień ekspresji genu dla selektyny E uległ 25,6-krotnemu zwiększeniu, po 3h – 93,5-krotnemu, a po 6h – 208,5-krotnemu. Jednakże po 24h nastąpiło jego zmniejszenie i w porównaniu z wartością wyjściową był już tylko 12,7-krotnie większy. Natomiast certolizumab pegol całkowicie hamował wpływ TNF i w tych samych przedziałach czasowych obserwowano następujące wartości: 1,2; 1,4; 1,2 oraz 1. W wypadku VCAM-1 oraz ICAM-1 największy wzrost stopnia ekspresji obserwowano po 3h. W tym miejscu warto także podkreślić, że inkubacja komórek tylko i wyłączenie z certolizumabem nie wpływała na stopień ekspresji genów. Ustalono jednocześnie, że certolizumab hamował działanie TNF w sposób zależny od dawki. Dawka 0,01 µg/ml była nieskuteczna, natomiast dawki w przedziale 0,1 – 100 µg/ml w sposób istotny niwelowały działanie TNF.

Kluczowym elementem odpowiedzialnym za zmianę ekspresji genów jest czynnik jądrowy κB (NF-κB). Przeprowadzono eksperyment oceniający translokację NF-κB p65 w komórkach HAoECs w odpowiedzi na stosowanie TNF. Wykazano, że już po 30 minutach inkubacji NF-κB ulega translokacji do jądra. Procesowi temu towarzyszyło zmniejszenie w cytoplazmie poziomu IκBα, czyli cytoplazmatycznego inhibitora NF-κB. Powyższa translokacja NF-κB była zahamowana przez certolizumab pegol.

W pracy podjęto także jeszcze jeden wątek, a mianowicie kwestię mikrocząsteczek (ang. micorparticles, MP), które są uwalniane/złuszczane z komórek aktywowanych lub apoptotycznych, a poziom MP pochodzenia płytkowego lub śródbłonkowego dodatnio koreluje ze stopniem uszkodzenia łożyska naczyniowego. Zbadano wpływ 24h inkubacji z TNF na tworzenie EMP w komórkach HAoECs. Zaobserwowano, że komórki inkubowane z TNF wyprodukowały 4,79-krotnie więcej EMP niż grupa kontrolna, a komórki inkubowane z TNF oraz z certolizumabem – tylko 1,56-krotnie więcej EMP niż grupa kontrolna.

Wyniki powyższej pracy dowodzą, że inhibitor TNF, certolizumab pegol, przyczynia się do zmniejszenia ekspresji cząsteczek adhezyjnych indukowanych TNF, hamuje aktywację szlaku NF-κB indukowanego TNF oraz zapobiega wytwarzaniu mikrocząsteczek z powierzchni aktywowanych komórek śródbłonka. Co więcej, wspomniane mikrocząsteczki mogą stanowi dodatkowy czynnik ryzyka naczyniowego i stanowić marker dysfunkcji śródbłonka.